Microbiological Colony Counting and Reporting

訓練模組：微生物菌落計數與報告

1. 學習目標

精確的菌落計數是環境監測與產品安全的基礎數據點，是證明製造環境持續處於受控狀態的主要證據。在 cGMP（現行優良製造規範，current Good Manufacturing Practice）設施中，這些數字不僅僅是觀察結果；它們是驗證我們的無菌製程依設計運作所需的實證數據。

完成本模組後，受訓者將能夠：

• 執行準確的菌落計數 ，運用放大、手動計數器及實體標記技術，以維持絕對的數據完整性。
• 區分複雜的型態，包括雙色菌落、蔓延菌落，以及黴菌（如 Aspergillus brasiliensis）的特定物種限值。
• 計算最終的微生物結果 ，無論是單一稀釋或重複稀釋，並遵守嚴格的有效數字進位規則。
• 遵循 GMP 審查流程，特別是辨識觸發管理層通知的條件，以及強制性的 24 小時審查期限。

達成這些目標是邁向維持合規微生物實驗室的第一步，使每一項結果都在科學上站得住腳且在法律上可辯護。

2. 為何這在現場至關重要

在無菌藥品製造工作流程中，微生物實驗室扮演產品品質「守門員」的角色。當生產著重於產量、化學著重於純度時，微生物團隊則確保環境免於可能危害無菌灌裝並危及病患生命的有害生物負荷。

不準確的菌落計數對無菌保證構成直接威脅。若「蔓延菌落」被誤判，或雙色菌落計數不足，設施可能無法偵測到環境控制的漂移。這在生物負荷測定中尤其關鍵；若我們因草率的計數習慣而錯失上升趨勢，便有釋出含有伺機性病原體產品的風險。遵循 SOP 是確保實驗室資訊管理系統（LIMS）所反映的數據真實呈現製造環境的唯一途徑。

為了專業地傳達這些發現，技術人員必須運用標準化的詞彙。如此可確保當結果上呈至品質管理部門或由法規稽核員審查時，對於受控狀態不致產生任何含糊之處。

3. 關鍵術語與定義

一致的術語是法規要求，可避免文件記錄中的錯誤，並確保品質部門間的無縫溝通。

• 菌落形成單位（CFU）： 用於報告樣品中存在的可存活細菌或真菌數量的計量單位。
• TNTC（過多而無法 計數 ，Too Numerous To Count）： 當菌落超過可計數限值時所使用的標示（例如標準培養皿 >250、接觸皿 >100，或標準培養皿上 >100 的 Aspergillus brasiliensis 菌落）。
• 蔓延菌落（Spreader）： 因細菌塌陷崩解或在水膜中生長，導致菌落無法明顯區隔的生長型態。
• LIMS（實驗室資訊管理系統）： 用於記錄、追蹤及授權所有實驗室數據的已驗證電子系統。
• 稀釋倍數： 用以從稀釋後的培養皿計數推算樣品原始濃度的數學乘數（例如 10、100、1000）。
• m-Endo 培養皿： 用於大腸桿菌群水質檢測的專用生長培養基，目標細菌會呈現特徵性的金屬光澤。
• 無菌技術： 在計數與審查過程中以防止引入二次「外來」污染的方式處理培養皿與樣品的操作方法。（註：雖屬基本的 cGMP 概念，但此特定定義已依計數程序的情境加以調整。）

在執行程序的實體步驟之前，精通這些術語至關重要。

4. 程序：逐步說明（附原理）

計數程序是一套受控的序列，旨在最大化準確度並消除人為偏差。

步驟 1：準備與視覺設置

• 務必使用菌落計數器或放大鏡，以確保小型 CFU 清晰可見。
• 若計數值偏低，將培養皿正放。若計數值偏高，將培養皿倒置並從背面計數（若培養基為透明）。
• 操作： 計數時以記號筆在培養皿背面實體標記每個菌落，並使用手動計數器追蹤累計數。

為何重要： 實體標記是關鍵的「防錯」習慣，可避免重複計數或遺漏菌落，確保輸入 LIMS 的數據可驗證且準確。

步驟 2：處理型態與物種限值

• 雙色菌落： 若單一菌落呈現兩種明顯不同的型態或顏色（例如一半黃色／一半白色），應計為 兩個 個別菌落。
• 蔓延菌落： 將一連串的菌落計為一個單位。若蔓延菌落是由水分擴散所造成，亦計為一個單位。
• 黴菌（Aspergillus brasiliensis）： 由於其體積大且具蔓延性，可計數限值較低。若計數超過 100x25mm 培養皿上的 100 或接觸皿上的 50 ，則報告為 TNTC。

為何重要： 因未能辨識雙色變化而少報菌落，或對黴菌計數處理不當，會導致生物負荷概況不準確，可能掩蓋污染事件。

步驟 3：計算邏輯與可計數範圍

執行用於生物負荷測定的總菌落計數測定時，應套用以下邏輯：

為何重要： 25–250 範圍在統計上最為可靠。依賴此範圍以外的計數值會為我們的生物負荷測定引入數學上的不穩定性。

步驟 4：進位至有效數字

• 當對重複培養皿或連續稀釋取平均時，必須將最終結果進位至與計算中所用 原始較高計數值 之有效數字相符。
• 範例： 若計數值為 218 與 229，平均為 22,350。由於較高計數值（229）具有三位有效數字，結果必須進位至 22,300。

為何重要： 正確進位可避免實驗室將生物測定的精密度「過度陳述」至超出該方法統計能力的程度。

步驟 5：輸入後的處理與審查

• 在結果於 LIMS 中獲得授權之前， 不可 丟棄培養皿。
• 將培養皿穩固堆疊、貼上 LIMS 批次標籤，並將待鑑定的候選樣品移至指定冰箱。

為何重要： 實體培養皿即為「原始數據」。在銷毀之前，它們必須持續可供二次審查，以驗證技術人員計數的準確性。

5. 稽核員或檢查員會關注什麼

在 cGMP 環境中，「若未記錄，即視同未發生」。稽核員著重於所報告每一個 CFU 的可追溯性。

關鍵稽核重點：

• 法規一致性： 驗證實驗室遵循 FDA Bacteriological Analytical Manual (BAM) 與 USP <32> 以進行生物負荷測定。
• 24 小時規則： 唯有在審查發生於原始計數後 24 小時 內時，審查者方可在未經管理層核准的情況下變更計數。
• 管理層通知觸發條件： 在以下情況下，必須進行強制性文件記錄與管理層通知：
  • 計數變更超過 10%。
  • 變更觸發超出限值（OOL）或不符規格（OOS）結果。
  • 變更需要進行新的微生物鑑定（ID）。
• LIMS 授權： 時間戳記必須顯示批次是在實體審查培養皿 之後 才關閉並授權。
• 丟棄時機： 確認培養皿在 LIMS 驗證後，直至當班結束前皆未丟棄於生物危害廢棄物中。

6. 常見錯誤及如何避免

即使是經驗豐富的技術人員，也可能養成危及數據完整性的習慣。

• 「合併」菌落錯誤： 將具有兩種明顯不同顏色的菌落計為單一單位。
  • 修正： 使用解剖顯微鏡來區分個別菌落、蔓延菌落及非微生物顆粒。
• 過早丟棄： 在培養皿於 LIMS 中獲得授權之前即予以丟棄。
  • 修正： 設立「已完成審查」區；唯有在 LIMS 批次關閉後，培養皿方可移至該區。
• 以平均值進位： 依平均值而非原始有效數字進行進位。
  • 修正： 辨識具有最多有效數字的原始計數值（即較高計數值），並將最終結果進位至與該精密度相符。
• 未告知的計數變更： 在審查期間將計數調整 >10% 而未通知管理層。
  • 修正： 任何超過 10% 的差異皆屬「管理層觸發條件」，需正式的文件記錄與監督。

7. 知識檢測

1. 標準 100 x 25 mm 培養皿上 Aspergillus brasiliensis 的 TNTC 閾值為何？ a) 250 CFU b) 100 CFU c) 50 CFU d) 25 CFU

2. 建議使用哪種工具來區分真正的菌落、蔓延菌落及顆粒？ a) m-Endo 培養基 b) 手動按壓式計數器 c) 解剖顯微鏡 d) LIMS 批次標籤

3. 在 m-Endo 培養皿上評估大腸桿菌群水質檢測時，關鍵的型態指標為何？ a) 絨毛狀、蔓延性生長 b) 雙色（黃色與白色）菌落 c) 金屬光澤 d) 連串的菌落

4. 簡答題：若系列中最低稀釋度（1:10）顯示零菌落，最終報告中的結果必須如何格式化？

5. 簡答題：某審查者在原始計數後 6 小時發現一項計數錯誤。變更幅度為 15%。他們可以獨自進行此變更嗎？為什麼可以或為什麼不可以？

解答：

1. b) 100 CFU。 （原理：黴菌因其體積與蔓延特性，具有較低的可計數限值）。
2. c) 解剖顯微鏡。 （原理：SOP 明確建議以此區分型態）。
3. c) 金屬光澤。 （原理：此為該培養基上大腸桿菌群生長的特定指標）。
4. 解答：<10 CFU/g 或 mL。 （原理：結果必須表示為「小於」最低稀釋度，並包含適當的單位）。
5. 解答：不可以。 （原理：雖然仍在 24 小時期限內，但任何超過 10% 的變更皆需管理層通知與文件記錄）。

8. 工作準備度連結

菌落計數是 QC 微生物學家 與 實驗室技術人員的核心職能。它是環境監測與總菌落計數測定中的主要任務。

Zentrum24 結業者應展現：

• LIMS 紀律： 認知到計數在獲得授權與驗證之前並非「真實」。
• 型態專業： 準確辨識蔓延菌落與雙色菌落，以確保生物負荷的準確性。
• 數學嚴謹性： 從複雜的稀釋中計算結果，並套用 cGMP 進位規則，以確保數據 可供稽核。

透過精通這些技能，您將成為確保我們產品安全與無菌的最後一道防線。